传统蛋白质印迹
一抗
蛋白质印迹实验的成功依赖于使用针对蛋白质印迹验证过的可靠抗体。Bio-Techne 的蛋白质印迹抗体产品组合包括高频引用的单克隆和重组一抗，我们承诺 100% 质保。
特色蛋白质印迹一抗
按物种分类的蛋白质印迹一抗
其他蛋白质印迹支持产品
除了抗体和裂解物对照外，Bio-Techne 还提供其他支持产品来助力蛋白质印迹实验取得成功，包括 HRP 稳定剂、亚细胞分离试剂盒、蛋白质阶梯和蛋白质印迹膜。
蛋白质印迹支持产品
| HRP 稳定剂 | Ponceau S 染色液 | PBS 缓冲液（片剂） | RunBlue 预染色分子量标志物-三色 |
| 重组未染色蛋白质阶梯 | 重组蛋白质印迹蛋白质标准品 | 亚细胞分离试剂盒 | 蛋白质印迹膜 |
| 肽抑制剂 | 其他支持产品 |
Simple Western™ 自动化蛋白质印迹系统
众所周知，蛋白质印迹法劳心费力，难以进行。为了克服传统蛋白质印迹法的难题，来自 Bio-Techne 旗下品牌 ProteinSimple 的 Simple Western™ 提供全自动毛细管蛋白质印迹分析。蛋白质印迹技术中传统进行的步骤如分离、固定、洗涤和检测在台式毛细管电泳仪内部可自动执行完成。
- Simple Western 提供高通量蛋白质印迹分析，仅 3 小时内就获得多达 25 份样本的全定量性结果，或过夜获得 96 份样本的全定量性结果。
- 借助 Jess™ 上的 Stellar™ 模块，Simple Western 用户获享高灵敏度的近红外/红外 (NIR/IR) 荧光检测。
- Simple Western 用 RePlex™ 替代传统蛋白质印迹检测中耗时费力的洗脱-重杂交，去除了第一轮杂交剩余的抗体，用新鲜抗体进行第二轮杂交，或进行总蛋白归一化。
Jess 上的 Simple Western 对比传统蛋白质印迹
现在，您可用 Milo™ 在单细胞中进行蛋白质印迹分析
对单细胞蛋白质组学感兴趣？ Milo™ 是我公司的单细胞蛋白印迹技术平台，可在单次运行中测量约 1,000 个单细胞中的蛋白质表达。借助全球首项单细胞蛋白印迹技术 Milo，验证您的 RNAseq 数据、分析荧光激活细胞分选术 (FACS) 所分选的细胞并深入了解单细胞蛋白质组学。
相关的蛋白质印迹资源
Background Information
蛋白质印迹法是一种使用抗体鉴定细胞或组织裂解物中蛋白质的实验室方法。归因于抗体结合的特异性质，蛋白质印迹分析可用于检测和定量数千种不同蛋白质混合物中的单一蛋白质。在蛋白质印迹法中，将样本加载到聚丙烯酰胺凝胶上，并根据其分子量通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE) 分离。
- 样本制备：蛋白质印迹获得成功的第一步就是样本制备，需要进行细胞裂解以分离蛋白质、蛋白水解、去磷酸化以及变性。有关蛋白质印迹样本制备的信息，请查看我们的样本制备方案。
- 分离： 将样本上样到聚丙烯酰胺凝胶上，并根据蛋白质分子量通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE) 分离。使用的聚丙烯酰胺凝胶由两部分组成：成层胶和分离胶。成层胶含有较少丙烯酰胺且具有较低 pH。这种环境允许样本中的蛋白质形成高度限定的鲜明条带。 蛋白质从成层胶进入分离胶，后者碱性更强且具有较高凝胶浓度。这导致蛋白质按大小分离，蛋白质越小，穿过凝胶越快。请查看我们的 SDS-PAGE 凝胶电泳实验方案。
- 转膜：然后通过施加电流将蛋白质转移到膜上。查看我们的蛋白质转膜实验方案。
- 染色：将膜与对目的靶蛋白具有特异性的一抗共同孵育。施加与酶或荧光色素结合的二抗到膜上，以可视化蛋白质/抗体复合物。
- 可视化：在其分子量处将显现一个条带，如分子量阶梯所标记。有关抗体染色和可视化的更多信息，请查看我们的免疫印迹实验方案。
传统蛋白质印迹实验方案概述
(A) 通过聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE) 分离蛋白质，(B) 将蛋白质转移到膜上（如硝酸纤维素膜或 PVDF）以进行检测。(C) 在膜上用对靶蛋白具有特异性的一抗杂交，通常接着使用酶偶联二抗检测抗体-抗原复合物。酶（例如辣根过氧化物酶，HRP）作用于底物（例如电化学发光，ECL）来发光，(D) 产生的信号被放射自显影胶片或化学发光成像系统捕获。进一步了解完善蛋白质印迹的方法。
完成蛋白质印迹后，脱膜以去除一抗和二抗，以便该膜可以与其他抗体一起孵育。有关此过程的更多信息，请查看我们的洗脱-再杂交实验方案。
什么是 SDS-PAGE？
SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳）是一种常用于根据大小分离蛋白质的电泳方法。SDS 是一种阴离子去垢剂，它带有负电荷，与蛋白质结合并破坏负责蛋白质三维结构的非共价力，从而使蛋白质变性。SDS 还向蛋白质给予与其大小相关的均匀净负电荷。这导致变性的蛋白质在电泳期间仅根据其大小迁移穿过凝胶。研究人员通常在蛋白质印迹前进行 SDS-PAGE。SDS-PAGE 分离蛋白质，而蛋白质印迹涉及将蛋白质从凝胶转移至膜，并利用抗体确认蛋白质的存在/不存在/表达水平。
什么是天然 PAGE 及为何可能使用它？
天然或非变性凝胶不使用 SDS，也不向上样缓冲液添加还原剂，如二硫苏糖醇 (DTT) 或 β-巯基乙醇。这意味着蛋白质维持其天然结构和电荷。因此，这些蛋白质在电泳期间根据其质量和电荷二者迁移穿过凝胶。天然凝胶用于确定蛋白质的聚集状态、研究蛋白复合物和分离酶。
应上样多少样本用于蛋白质印迹法？
蛋白质印迹实验中，上样蛋白质的量取决于若干因素，包括蛋白和被检测蛋白的表达水平。作为经验法则，对于细胞与胞核裂解物和膜样本，每孔加载 20-30 µg 的总蛋白质。如果检测纯化蛋白，通常上样 10 至 100 ng 蛋白质。但是，应在蛋白质印迹实验开始前，确定合适的蛋白质上样量。
蛋白质印迹需要什么类型的对照？
适当的蛋白质印迹对照对确定问题起源和验证结果非常重要。蛋白质印迹实验应包括以下几种对照。
1. 阳性对照裂解物 – 阳性对照裂解物来自已知表达目的蛋白的细胞系或组织样本。这种对照会在蛋白质印迹时产生阳性条带。此对照很重要，它用于确保蛋白质印迹实验方案没有问题，并确保任何阴性结果归因于样本中不存在蛋白质，而不归因于程序问题。
2. 阴性对照裂解物 – 阴性对照裂解物来自已知不表达目的蛋白的样本。这种对照不会在蛋白质印迹时产生条带。此对照对确定抗体非特异性结合非常重要。
3. 阳性内源性对照裂解物 - 阳性内源性对照裂解物来自已知表达目的靶标的样本。测试重组蛋白样本（如标记的蛋白质）时应使用此对照。重组蛋白的折叠可能异于天然蛋白质，并且错误折叠可能阻止抗体接近表位。此对照将会让研究人员知道，阴性结果归因于表位遭阻断，而不是实验方案不起作用。
4. 上样对照 – 上样对照是管家基因蛋白，它们是在几乎所有组织和细胞中以同等水平表达的蛋白质。此对照确保孔间蛋白表达差异不归因于上样误差或蛋白转移误差。孔间蛋白质水平的半定量分析需要上样对照。
Simple Western 与蛋白质印迹之间有什么差异？
Simple Western 分析是基于毛细管电泳无缝衔接免疫检测的全自动蛋白质印迹系统。该平台使涉及电泳技术和蛋白质印迹技术的所有步骤（如蛋白质上样和分离、免疫探测、洗涤、检测和数据定量分析）自动化。查看 Bio-Techne 的 Simple Western 概述页面，更多了解 Simple Western。
为什么在蛋白质印迹实验中实际的蛋白质条带大小与预测的不同？
一般来说，蛋白质迁移穿过 PAGE 凝胶基质时，是根据其大小（分子量，MW）进行分离的。蛋白质越小，穿过凝胶的迁移速度越快。然而，迁移可能还受其他因素的影响。因此，观察到的实际条带大小可能与预测大小不同。其中一些因素包括翻译后修饰、翻译后切割、剪接变异、相对电荷变异，以及形成蛋白质多聚体。
在蛋白质印迹实验中检测磷酸化表位时，应使用什么作为封闭缓冲液？
在蛋白质印迹实验中检测任何磷酸化蛋白时，一项通用指导原则是，通常推荐使用 5% w/v BSA（在 TBST 中），因为牛奶含有酪蛋白，这是一种磷蛋白，因此可能会因为检测到牛奶中的酪蛋白而出现高背景信号。
有关蛋白质印迹的更多问题，
请查看我们的蛋白质印迹故障排除指南。